糖尿病视网膜病变是糖尿病微血管主要并发症之一，是糖尿病患者视力下降、失明的主要原因。关于糖尿病视网膜病变的发生机理尚未完全明了，研究表明氧化应激在其发生发展中起重要作用^[1，2]。实验研究证实锌离子对急性高眼压大鼠视神经^[3]有保护作用，也可以提高人体的氧化应激能力^[4]。本实验旨在观察锌离子对糖尿病大鼠视网膜GSH和MDA的影响，探讨其作用机理，为临床应用锌离子制剂治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：Wistar大鼠（雌雄不限，体重200 +/- 50 g）72只，由重庆医科

大学实验动物中心提供。

实验用药及主要试剂：氯化锌、冰醋酸（国产分析纯）；链脲佐菌素（streptozotocin,STZ Sigma公司）；罗氏血糖诊断试纸（桐君阁大药房）；胰岛素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；GSH、MDA测试盒、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

实验用主要仪器：玻璃匀浆器、低温离心机、血糖仪、精密电子天平、722型光栅分光光度计、解剖显微镜、γ-计数器、0_~4⁰C冰箱、-70⁰C冰箱

1.2 方法

动物分组：72只Wistar大鼠随机分为正常对照组，糖尿病模型组，氯化锌干预组，每组24只。

动物模型制作：大鼠适应性喂养1周，禁食12h，以60mg/kg STZ（临用前用0.1mmol/L、pH4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成2%的溶液）快速一次性左下腹腔注射建立糖尿病模型，干预组24只同时右下腹腔注射氯化锌10mg/kg。于处死前测量血糖水平以确定糖尿病模型成功与否。正常组仅予以等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，处死前测量的血糖值为正常血糖。

取材：大鼠用10%水合氯醛麻醉心脏采血大约2ml，室温（20⁰C_~25⁰C）静置2h后离心取血清0.5 ml在-70⁰C冰箱保存；剖腹剪一块胰腺组织，摘取眼球，去除眼前节，显微镜下分离视网膜，胰腺和视网膜用冷生理盐水洗净，精密天平称重。

血糖、胰岛素水平的测定：断尾采血用血糖仪测血糖，用放射免疫法检测血清胰岛素水平。

视网膜和胰腺GSH测定（整个实验过程在低温环境下进行）：按重量体积比加生理盐水制成10%组织匀浆，3000r/min离心10min，然后取组织匀浆上清按照试剂盒说明操作测GSH。

视网膜MDA的测定（整个实验过程在低温环境下进行）：10%组织匀浆用生理盐水按1:4体积比制备成2%组织匀浆，并且视网膜组织匀浆不离心，按照试剂盒说明操作测MDA。

视网膜和胰腺蛋白定量：将10%的组织匀浆上清再用生理盐水按1:4体积比稀释按照考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒说明操作进行组织蛋白定量。（用来计算GSH和MDA的量）

1.3 统计学处理

实验数据以均数±标准差（x±S）表示， t检验分析。р<0.05有统计学差异。

2 结果

2.1链尿佐菌素和锌离子对大鼠血糖和胰岛素水平的影响

与正常组相比，血糖值在模型组和干预组相应时间点均显著升高，但是干预组相应时间点血糖水平低于模型组；血清胰岛素水平在模型组和干预组处理后24h明显升高，48h、72h低于正常组，但是干预组相应时间点胰岛素水平高于模型组。见表1

      表1各实验组各时间点血糖(mmol/L)和胰岛素水平(μIU/mL)（均数+标准差）                        

                                  Time(h)                              

   Group               24               48              72                           

control  BG           7.13±0.19         7.15±0.29           7.20±0.32

         Insulin     12.48±1.26         12.50±0.98         13.71±1.68         

model    BG          23.37±1.94^-         25.55±3.73^-        24.73±2.07^-

       Insulin     19.32±1.08^-         10.50±1.16^-         8.24±0.70^-

ZnCl₂     BG         21.33±1.16^{- -}        22.05±2.70^{- -}        21.27±1.66^{- -}

         Insulin     21.31±2.50^{- -}        12.94±1.85^{- -}        10.20±1.72^{- -}      

-р<0.05 vs control, --р<0.05 vs model                                      

2.2链尿佐菌素和锌离子对大鼠视网膜和胰腺GSH的影响

处理24h、48h和72h后，模型组视网膜和胰腺GSH含量比正常组相应时间显著降低，干预组视网膜和胰腺GSH含量低于正常组相应时间（р<0.05），而模型组和干预组视网膜和胰腺GSH含量差别具有统计学意义。见表2

    表2各实验组各时间点视网膜、胰腺GSH(mg/g prot.)水平的变化（均数+标准差）                 

                                       Time(h)                         

    Group                 24               48              72           

          Retina      6.12±0.81         5.96±1.03           6.04±0.84

control   Pancreas   15.05±1.51        15.66±1.27          14.85±1.74

        Retina      4.50±0.46+        4.01±0.73+          3.46±0.51+ 

model     Pancreas   11.38±0.59+        8.59±0.73+          7.94±0.69+

          Retina      5.32±0.57⁺⁺        4.69±0.51⁺⁺          4.39±0.48⁺⁺

ZnCl₂     Pancreas    13.20±1.16⁺⁺      10.46±0.65⁺⁺           9.09±0.56⁺⁺

+р<0.05 vs control,++ р<0.05 vs model                  

2.3 链尿佐菌素和锌离子对大鼠视网膜MDA的影响

模型组和干预组视网膜MDA含量比正常组相应时间段增高（р<0.05），但是模型组和干预组视网膜MDA的含量差别具有统计学意义。见表3

 表3各实验组各时间点视网膜MDA水平(nmol/mg prot.)的变化（均数+标准差）           

                    Time(h)                         

  Group                    24             48            72                                  control    Retina        2.53±0.39         2.47±0.42         2.79±0.44

model      Retina        3.48±0.41*        4.87±0.60*        5.56±0.21*  

ZnCl₂      Retina         2.93±0.42^#        4.14±0.44^#        4.69±0.58^#        

*р<0.05 vs control,# р<0.05 vs model                             

3 讨论

糖尿病视网膜病变的发生比较复杂，研究认为糖尿病视网膜病变的发生发展与高血糖引起的一系列生化改变及细胞增殖调控失常有关，许多研究表明氧化应激在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用^[1，2]。高血糖作为应激原产生的活性氧，可以损伤组织引起细胞凋亡，造成视网膜破坏致不可逆性损伤，最后可产生一系列病理生理改变及临床表现^[5]。

加强血糖控制可以降低和延缓糖尿病视网膜病变的发生发展，但是有许多患者并不能达到此目的。因此，通过抗氧化维持视网膜结构和功能的完整性阻止视网膜病变的发生发展可能更重要。本实验数据表明糖尿病大鼠视网膜GSH含量下降而脂质过氧化产物MDA含量增高，与以往的报道一致。许多研究表明抗氧化治疗在糖尿病视网膜病变发生发展中具有重要作用^[6,7]，然而，有的抗氧化剂不能起到降低血糖的作用^[6]，有的则不能降低脂质过氧化产物的含量^[7]。本实验结果证实锌离子既能够降低糖尿病大鼠血糖和视网膜MDA水平，又能够提高视网膜GSH的含量，可能对阻止和延缓糖尿病视网膜病变的发生发展具有重要作用。

实验说明MDA水平和血糖变化一致(表1,3)。脂质是细胞膜重要组成部分，对维持细胞膜结构完整和功能正常起重要作用，氧化应激产生的自由基引起组织脂质过氧化产物增加使细胞结构和功能受损。模型组STZ对胰腺的直接破坏使其降血糖功能减低，因此可以使大鼠发生高血糖。氯化锌干预组视网膜MDA和血糖水平均比模型组低，锌离子可能是通过稳定细胞膜对抗脂质过氧化作用^[8]，另外锌离子有诱导金属硫蛋白合成的能力，金属硫蛋白可以有效清除氧自由基^[9]，减轻氧自由基对糖尿病大鼠视网膜的损伤，可以维持其结构的完整性和功能的正常性。

维持蛋白质还原状态是细胞发挥正常功能的前提，而蛋白质结构改变是糖尿病并发症发生的分子机理之一^[10]。还原型谷胱甘肽是细胞内一种重要的非酶性抗氧化剂，它不仅可以稳定细胞膜，维持细胞的完整性、对抗活性氧对组织的损伤，而且还是谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶等酶性抗氧化剂的底物。因此，细胞中GSH水平的高低可以反映组织受损程度或其抗氧化能力的大小。与正常组相比，模型组大鼠视网膜GSH水平明显降低，高血糖产生的氧自由基能够消耗视网膜GSH而使视网膜正常功能受损，容易发生视网膜病变。而干预组视网膜GSH水平比模型组高，其下降幅度也较低，锌离子主要通过稳定细胞膜和增加金属硫蛋白合成的能力从而减少视网膜GSH的消耗，增强其抗氧化能力。同样，STZ对胰腺组织的直接损伤使胰腺GSH水平在模型组显著降低；血清胰岛素水平在处理后48h和72h降低，这是由于胰岛或胰腺细胞胰岛素合成功能受损；而在处理后24h高于正常组，可能是胰腺储存胰岛素释放的结果。干预组胰腺GSH和血清胰岛素水平均高于模型组，说明锌离子有保护胰腺的作用。

总之，我们的研究表明锌离子对糖尿病大鼠视网膜有保护作用，锌离子不仅可以对抗氧自由基对视网膜的损伤，而且还通过对胰腺的保护作用间接降低血糖。